假阳性的预防及处理，每一位 PCR 实验人员都绕不开的必修课

8646 人阅读发布时间：2021-04-13 14:06

PCR 技术因其快速，灵敏、特异等特性广泛应用于分子生物学的研究与检测中，但却对实验环境及操作有着严格的要求，稍有不当则会导致假阳性产生。污染严重时甚至可以持续数月，很难在短时间内控制。换引物、换试剂、换耗材、换实验楼，甚至有人跑到两公里外的实验室加样也无济于事，如何避免及处理假阳性问题已经成为每一位 PCR 实验人员的必修课。

1、什么是 PCR 假阳性

PCR假阳性包括两种，即检测阴性材料得到阳性结果；检测空白对照（加入去离子水）出现阳性结果，实验中设立的阴性对照可以提示有无假阳性结果出现。

假阳性结果示例 1（Q1600 荧光检测）

2、PCR 假阳性的原因有哪些
PCR扩增产物污染是导致假阳性的重要因素，因其拷贝量大，微量的污染源即可导致阳性结果，其中以气溶胶污染最为常见。
其次，PCR 试剂及样本的交叉污染也会导致假阳性。PCR 试剂的污染包括加样枪、容器、双蒸水及其它溶液的核酸污染，样本污染主要是取样工具之间的交叉污染或加样污染。
此外，在实验室操作中经常会用到阳性参考品，参考品大多数由某些克隆质粒制作而成，克隆质粒使用不当也会造成污染。

假阳性结果示例 2（RepureA 电泳检测）

3、假阳性的预防及解决措施
①规范实验室设计：实验室包括配液区、DNA 提取区、扩增区、电泳区，在连续独立的空间完成不同实验操作。若没有专业的实验室，至少需要保证配液、加样与检测在不同的区域；
②规范实验室操作：实验室定期通风与消毒，仪器定期清洁，并使用气溶胶清除剂。使用一次性用具，小心操作，避免交叉污染；
③规范试剂耗材管理：新买试剂需进行实验前验证并进行分装，所用耗材需高压消毒；
④实验前预防：首先需保证所设计引物的特异性，防止引物自扩增，其次还可使用 UNG 酶及dUTP 防污染体系；
⑤污染后处理：如遇污染应立即停止实验，采取开窗通风，紫外灯照射，喷雾装置喷洒等操作，此后若连续三天阴性对照正常即可恢复正常实验。