畜牧业是我国经济发展的重要组成部分，对于基层养猪户来说，由于受多种外在因素的影响，养猪场会出现多种猪类相关疾病。对于猪场养殖户来说，猪仔患病，如果诊断治疗不及时，有可能带来巨大的经济损失。常见猪类疫病如口蹄疫等多是由病毒引起，塞内卡谷病毒（SVV）也是其中一种。




山东师范大学生命科学学院硕士研究生导师陈蕾教授课题组在《Analytical Biochemistry》新发表了题为 Recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of Seneca Valley Virus 的研究论文，探讨研究了重组酶聚合酶扩增 (RPA) 快速检测 SVV 的方法。

 

摘要内容

塞内卡谷病毒（SVV）的快速准确检测对于确定致病因素和启动控制措施的实施至关重要。 开发可在样品采集点使用的快速、简单、方便和低成本的分子（核酸扩增）测试方法已被确定为控制塞内卡谷病毒（SVV）的关键要素。作者研究团队描述了针对 SVV 保守区域的重组酶聚合酶扩增 (RPA) 测试的开发，以用于检测 SVV。 研究人员设计的引物和探针在 RPA 检测中表现出良好的敏感性和特异性，有助于 RPA 成为快速诊断 SVV 的有效工具。

背景介绍

2002 年，美国研究人员偶然从 PER.C6 细胞（转化的胎儿成视网膜细胞）培养基中首次发现并分离到一种新的病毒——塞内卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV，又称 Seneca virus A，SVA）。塞内卡谷病毒（Seneca Valley Virus，SVV）属于小 RNA 病毒科塞内卡谷病毒属中的一员，临床症状与其他水疱病临床症状如口蹄疫类似，引起新生仔猪大量死亡和成年猪口部和蹄部出现水泡。



自 2002 年确定以来，SVV 主要在美国和加拿大零星散发，但自 2014 年年底后，SVV 先后在多个国家大范围流行。2015 年传入中国以后，SVV 先后在福建、广州、湖南、湖北、安徽、江苏、浙江、河南、河北、辽宁、黑龙江等 12 个省份引发疫病。塞内卡谷病毒（SVV）传播特性与口蹄疫病毒类似，且与口蹄疫病毒存在混合感染，严重干扰了口蹄疫的防控。

目前多种分子技术手段已被用于检测塞内卡谷病毒（SVV），包括聚合酶链式反应 (PCR)、滚环扩增 (RCA) 和环介导等温扩增 (LAMP) 等。 在现有的等温扩增技术中，重组酶聚合酶扩增 (RPA) 可能是最适用于现场和即时诊断（point-of-need diagnosis）的方法。

RPA 利用低温孵育（37–42℃）进行反应 ，只需最少的样品制备，且扩增时间短（约 20 分钟），灵敏度高（每个反应 1-10 copies）。本研究介绍了 SVV 保守区引物和探针的设计，并评估了其在 RPA 实验中的表现。

实验方法：

试验中用到的塞内卡谷病毒（SVV）cDNA、口蹄疫病毒 (FMDV) cDNA、猪呼吸与生殖综合征病毒 (PRRSV) cDNA、猪瘟病毒 (CSFV) cDNA、猪流行性腹泻病毒 (PEDV) cDNA、传染性胃肠炎冠状病毒 (TGEV) cDNA 和阴性猪 cDNA 均由山东省疾病预防控制中心提供。本研究中使用的病毒样本均在阴性猪 cDNA 中稀释到一定浓度。经基因工程技术把靶标基因克隆装载到特定载体中，得到重组质粒 pET-32a SVV，重组质粒浓度为 300 ng/μL。类似实验操作的得到其它病毒质粒 (pET-32a-FDMV, pET-32a-PRRSV, pET- 32a-CSFV, pET-32a-PEDV, pET-32a-TGEV)。

之后设计并合成特定引物及探针，进行重组酶聚合酶扩增 (RPA) 测试，实验反应在等温扩增荧光检测仪（H1600，柏恒科技）上进行，在 42°C 温度条件下开始扩增，反应约 20 分钟。产生高于阴性对照阈值的指数扩增曲线的样品被认为是阳性的。后续研究团队对 RPA 进行了特异性、敏感性及重复性的分析，结果均显示良好。



结论：

该研究描述了 RPA 法检测 SVV 的特异性引物和探针，具有良好的灵敏度和特异性，快至 8 分钟即可产生阳性结果，一般不超过 20 分钟。 塞内卡谷病毒（SVV）RPA 检测是在柏恒科技的等温扩增荧光检测仪 H1600 上进行的，仪器体积小，重量轻，方便携带。

实验结果表明，特异性引物和探针有助于 RPA 技术成为 SVV 快速检测的良好候选技术。它可以检测患病动物，以便及时治疗和控制感染传播。

实验中用到的等温扩增荧光检测仪 H1600 为柏恒科技生产，仪器检测快速，体积小，可用于便携式操作，适用牧场、林场、动物疫病检测等多场景。



此外柏恒还提供动物疫病检测解决方案，我们提供包括离心机、金属浴、PCR 仪等全流程实验仪器，更多内容，欢迎咨询联系。



参考文献：

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