1983 年，Mullis 在水浴锅中实现了 DNA 体外复制的伟大壮举，奠定了分子生物学的研究基础。随后，Taq 酶的发现及仪器的发明促进了 PCR 技术的推广使用。如今，以微流控芯片和微滴技术为代表的第三代 PCR 技术正处于高速发展阶段，PCR 反应开始向小体积、高通量、高灵敏度的特性过渡。


纳升体系 SNP 基因分型芯片及扩增平台

在以往的 PCR 实验中，反应的「五要素」常被认为是影响结果的关键因素，即引物、酶、dNTP、模板及 Mg2+浓度。近年来，以仪器-耗材-试剂组成的反应系统越来越引起关注，三者之间质量不一或兼容性差也会导致最终的实验效果不佳。

1、PCR 仪器选择及功能设置

仪器的控温方式、荧光器件及数据处理都会影响反应的最终结果，在使用时要仔细了解仪器的各项设置及注意事项，避免操作不当影响最终的反应结果。

酶延伸的时间缩短，并不能保证 PCR 具有最佳的扩增效率及特异性，同时也会导致芯片出现气泡及蒸发问题。为此，对于特殊的实验而言，为获得稳定的反应条件，降低变温速率是一个较好的选择。

• 变温速率是不是越快越好：由于升降温速率大幅度提高，使得聚合

• 低温保存功能的设置：低温保存功能使用的前提是不能将 PCR

仪当成冰箱进行长时间的使用，损耗机器的同时也增加了实验结果的不确定性。对于一般实验而言，低温设置为 12℃ 左右即可满足需求。

仪器高级设置中可对变温速率进行设置

2、酶系统的选择及使用

普通的 PCR 实验选用 Taq 酶即可。对于特殊实验，酶的主要区别在于特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等几个指标。如 Pfu 聚合酶适合保真度要求较高的实验（点突变、基因筛选等）；Long Taq、Taq Plus 聚合酶适合高保真长片段扩增（构建基因图谱等）；Taq Platinum 聚合酶扩增 GC 含量较高或二级结构较复杂的模板。对于等温 PCR 系统而言，LAMP 使用链置换 DNA 聚合酶 Bst 聚合酶，RAA 则使用包括重组酶、SSB、聚合酶及外切酶等组成的酶系统。

不同的酶具有不同的实验功能及特性，在选择时需要加以区分。除此之外，预混液的使用、试剂的储存方式及冷冻干燥方式都会对酶的活性造成影响，在使用时也要注意进行综合考虑。

          
酶系统的选择及保存方式  （图片来自 Seegen 及博奥生物官网）

3、实验耗材导致的试剂蒸发等问题

PCR 反应的耗材包括 PCR 管、微孔板、毛细管、芯片等。在耗材选择时一定要注意其材质、孔径、密封性、是否使用回收料等，不同耗材对试剂离心、混匀、质量损失及荧光数据采集等有着不同程度的影响。以测试 96 孔反应板试剂蒸发为例，使用专业的实验耗材有助于减少样本的质量损失。计算公式如下：样本质量损失（%）=（W3-W4）/（W2-W1），样本质量损失越小代表其密封性越好。其中，W1 为空反应板的重量，W2 为反应板加入试剂后的重量，在此基础上密封反应板后的重量为 W3，在热循环结束后，记录耗材最终重量为 W4。

     
柏恒科技不同的反应板质量损失测试

「后 PCR 时代」下小体系快速实验对仪器、耗材、试剂的要求较高，所以选择专业的厂商很有必要。在实际使用中不仅要选的好，同样也要用的好。在熟悉反应系统的基础上应注意设计严谨的实验方法。同时规范每一步的实验操作，以减少实验失败的风险。